二药相伍，非是单单改头换面——双分子自组装增强抗菌活性

汇报人：硕士二年级朱耀萱

大家或许都有这样的经历——无论是在家中煎药，或是在实验室中提取复方中有效成分时，往往都会有沉淀产生。临床上有的大夫会交代，把沉底的“药渣”也喝下去。这究竟有没有科学道理呢？那所谓的“药渣”和我们看到的沉淀又是什么呢？

北京中医药大学的雷海民教授团队在研究黄连解毒汤时也发现了类似的情况，复方煎煮后有大量沉淀产生（Molecules，）。基于此，他们进行了拆方研究（中草药，），发现方中黄连和黄芩最易产生沉淀，通过分析沉淀中的组分并对沉淀进行模拟，并进一步引入超分子组装概念进行分析，发现了沉淀中小檗碱与黄芩苷和汉黄芩苷的超分子组装现象（ACSNano,）。该研究中发现，复方中的活性小分子通过超分子组装行为可以产生不同形态的纳米粒（球状和棒状），且形貌间的差异也对药效有所影响。这一研究表明，复方中起效的物质基础或许不止是活性小分子的简单相加或协同，还可能发生了相互作用导致结构上的变化。后续，该课题组还研究了小檗碱与大黄酸（APSB，）、肉桂酸（ACSAMI，）的超分子组装行为，并开展了相关抗菌活性的评价等工作。

此处详细介绍小檗碱配伍系列中与肉桂酸的超分子组装，相关文章于年12月发表在ACSAppliedMaterialsInterfaces上。

文章框架图

01

制备及表征

首先，作者先制备纳米粒。将肉桂酸的DMSO溶液（用碳酸氢钠调节pH至7.0-7.5）和小檗碱的甲醇溶液混合，室温搅拌均匀。然后将混合物缓慢加入预热的PBS（60℃）中，恒温搅拌15min。用PBS透析12h，最后得到组装的纳米粒溶液。

接着，作者对所得纳米粒进行表征。通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和透射电子显微镜（TEM），组装后的粒子为几乎均匀的球形粒子，粒径约为60?70nm（图1a和b）；动态光散射（DLS）测得纳米粒子的平均粒径为65.99±0.43nm，PDI=0.（图1c）。上述结果相互印证。作者还在不同pH的溶液中做了纳米粒的释放，图1e可见纳米粒具有缓释作用，且释放受对pH敏感。

图1.（a）CA-BBRNPs的FESEM图像。（b）CA-BBr纳米粒子的TEM图像。插图为局部放大图。（c）CA-BBr纳米粒子的粒度分布（PDI=0.，插图以示丁达尔现象）。（d）CA-BBr纳米粒子的Zeta电位。（e）在37°C下，CA-BBr纳米颗粒在不同条件下（pH为2.0和7.4）对BBr的增溶作用，数据是CA、BBr和CA-BBr纳米颗粒的叠加紫外吸收光谱的平均值±SD

接着，作者用相关谱学手段对纳米粒进行了表征。CA和BBr的特征吸收峰分别出现在nm和nm处，而CA-BBr纳米粒子的最大吸收峰位于nm，这表明CA和BBr在纳米粒子中同时存在，也说明CA-BBr纳米粒制备成功（图1f）。FI-IR谱（图1g）中，与CA的羰基伸缩振动带在cm-1处相比，CA-BBr纳米粒子的羧基振动带明显减少（cm-1）。这种位移表明羧基很可能是该组件的结合位点。氢谱的信息提示纳米粒子的自组装过程可能需要羧基、芳香环的参与和共轭结构的形成。基于上述信息，作者推测肉桂酸和小檗碱通过氢键和π?π堆积形成纳米粒。

图1.（f）CA、BBr和CA-BBr纳米粒子的叠加紫外吸收光谱。（g）CA、BBr和CA-BBr纳米粒子的傅里叶变换红外光谱。（h）CA、BBr和CA-BBr纳米粒子在CD3OD溶液中的MHz1HNMR谱。

02

组装机制探究

为了进一步揭示组装机制，作者做了X射线单晶衍射。基于谱学的信息和对衍射峰的归属，作者对组装体系的形成过程进行了合理推测，见图2a。

图2a.CA-BBr纳米粒子的自组装过程。（1）CA-BBr纳米粒子的单晶结构。（2）CA-BBR纳米粒子的三维堆积结构。

肉桂酸和小檗碱通过氢键和π?π堆积作用直接自组装成均匀的纳米粒。氢键驱动了蝶形一维单元晶胞的形成，π?π堆积作用进一步驱动了层状三维晶体堆积的形成，最终形成CA-BBr纳米粒。

03

安全性评价

作者对纳米粒的安全性进行了评价。有以下三个部分，体外溶血实验、细胞毒性实验和斑马鱼体内安全性实验。图3d显示，CA-BBR纳米粒及其单体在1.?50μM浓度范围内24和48h对MDCK细胞均无明显细胞毒性，在50μM浓度下孵育24和48h细胞存活率均在82%以上。溶血实验结果表明（图3e），CA-BBR纳米粒处理的大鼠红细胞（RBC）未见明显溶血反应，溶血率低于国际公认标准（5%）。斑马鱼实验中（图3f），不同浓度的CA-BBRNPs溶液（2.5?80μM）与一日龄的斑马鱼幼仔共孵育72h，整个实验过程中无斑马鱼死亡。且对照组和CA-BBRNPs治疗组均未见斑马鱼有明显的脊髓弯曲和形态学改变。这表明CA-BBR纳米颗粒对斑马鱼幼仔生长影响不大。上述的体内外安全性评价说明制备的纳米粒具有良好的生物相容性，具有很大的临床应用潜力。

图3.（d）用不同浓度的CA、BBR和CA-BBR纳米粒孵育MDCK细胞，观察细胞活力(24小时和48小时)。（e）经去离子水、PBS和不同浓度的CA-BBr纳米粒处理4小时的红细胞溶血试验。插图：离心后相应溶液的照片。（f）用对照和CA-BBR纳米颗粒处理斑马鱼幼体的照片。

04

药效学评价

接下来，作者对组装所得纳米粒进行抗菌活性评价。首先是对悬浮菌抗菌活性的评价。研究对象选用的是对一线抗生素（如图3a中的诺氟沙星、阿莫西林和四环素，最低抑菌浓度0.2μmol/mL）广泛耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。如图所示，CA-BBR纳米粒具有比小檗碱和其他三种抗生素更好的抑菌活性。浓度为0.μmol/mL的CA-BBr纳米粒抑菌活性良好，抑菌率为95.03±1.26%；而同浓度的小檗碱抑制率为36.60±0.80%，其他三种抗生素的抑制率均低于30%。平板抗菌结果与此相互佐证（图3b）。图3c可以看出，CA-BBR纳米粒在24h内对MRSA的生长动力学有明显的影响。

图3.（a）CA、BBR、CA-BBR纳米粒、诺氟沙星、阿莫西林和四环素的抑制率。*p0.05，**p0.01，***p0.（n=3）。（b）琼脂平板照片分别用0.μmol/mL的浓度处理。（c）相同浓度下BBR和CA-BBR纳米颗粒的生长情况。

生活中和临床上，细菌往往是以生物膜形式存在的，因此，清除成熟生物膜的能力也是评价抗菌药物活性的重要指标之一。因此，作者分别开展了XTT定量测定实验，并用FESEM和LSCM观察纳米粒处理与否的细菌生物膜的情况。如图4a-1所示，同浓度（0.1μmol/mL）下，CA-BBr纳米颗粒对成熟生物膜的清除率为64.22±3.0%，BBR组的清除率仅为32.98±1.62%，结果提示CA-BBR纳米颗粒对生物膜的清楚能力优于BBR（p0.）。图4b中，FESEM可以清楚地观察MRSA生物膜的变化，同浓度下纳米粒处理后的组别，其生物膜变薄变少。图4c为活/死BacLight细菌活性试剂盒染色后MRSA的荧光图像。活细菌发绿色荧光，死细菌发红色荧光。同浓度（0.1μmol/mL）下，NPs组红斑总数明显多于对照组和BBR组，提示NPs组仅有少量活菌存在，说明NPs组对生物膜清除的能力更强。上述实验也均能相互佐证。

图4.细菌生物膜去除的研究。（a）（1）XTT法检测生物膜清除率。与BBR组相比，*p0.05，**p0.01，***p0.（n=4）。（2）0.1μmol/mL浓度下XTT法测定BBR组和NPs组的染色图。（b）生物膜去除的FESEM图像。（c）活/死细胞染色图像。

05

抗菌机制研究

作者进一步对纳米粒的抗菌机制进行了研究。用FESEM和TEM观察了细菌的微观形态变化。图5a中可见，许多CA-BBR纳米颗粒可以定向包裹细菌对其进行破坏。图5b中FESEM图像证实，未经处理的细菌是球形的，细胞壁光滑而完整；BBR和CA-BBR纳米粒分别作用12h后，细菌的细胞壁发生破坏和皱缩。NPs处理的MRSA细胞的形态学改变比BBR处理的MRSA细胞的形态学改变更明显。此外，作者还用透射电镜观察了细胞壁和细胞膜的损伤，以及细胞内部结构的变化（图5c）。BBR组细菌细胞壁个别肿胀。NPs处理后的细菌细胞壁被破坏，并可见明显的细胞内物质外渗。此外，抗菌效果良好的原因可能与纳米粒的自粘性和持续释放特性密切相关。液质联用检测到细菌细胞内部含BBR（图5a插图）。

图5.抗菌机制研究。（a）CA-BBRNPs与MRSA之间的相互作用。插图显示了对MRSA中BBR的HPLC?HRMS/MS分析。（b）未加或加BBR和CA-BBR纳米粒处理的MRSA的FESEM图像。（c）未加或加BBR和CA-BBR纳米粒处理MRSA的透射电镜图像。

作者还进一步进行了RNA-seq研究。根据对照组、BBR组和NP组的基因表达谱，分别鉴定出个基因。然后测定BBR组和NP组之间差异表达基因（DEG）的数目，发现BBR组有个DEGs被调控，其中包括46个上调基因和80个下调基因（图6a-1）；NPs组中有个DEGs被调控，其中包括21个上调基因和个下调基因（图6a-2）。显然，NPs比BBR对细菌基因的调控范围更广。此外，作者发现NPs和BBR在相同的标准下有30个共享的DEGs（图6b）。qPCR结果（图6c）提示NPs对基因的调控作用比BBR更明显，从而表现出更好的抗菌活性。KEGG分析发现（图6d），BBR和NPs处理后，基因的表达主要与代谢（脂质、能量、碳水化合物和氨基酸）、翻译、复制和修复、信号转导及膜转运途径有关，NPs组较BBR组相比，相关基因比例更大。上述实验结果提示，CA-BBrNPs可以先包裹细菌，然后通过多种机制渗透和抑制MRSA。这可能是CA-BBRNPs抗MRSA比几种一线抗生素更有效的原因。

图6.转录分析。（a）（1）和（2）显示差异表达基因（DEGs）的火山图。绿色和红色区域分别表示表达下调和上调的基因。（b）BBR和CA-BBRNPs中DEG的韦恩图。（c）qPCR检测hrtA,secE,deoD,hrtB,andrpmG3的mRNA表达。与对照组相比，*p0.05，**p0.01，***p0.。（d）BBR和CA-BBRNPs之间的KEGG分析。

文章主要研究了小檗碱和肉桂酸通过氢键和π?π堆积作用直接自组装成有序的纳米粒，且所制得的纳米粒具有良好的生物相容性和持续释放性。此外，该纳米粒子可以自发地粘附在细菌上，渗透到细菌中，从而产生抗菌作用；生物信息学相关研究表明，纳米粒子的干扰会影响细菌微环境的许多方面，抑制细菌的生长。

自古以来，中药及其复方的临床效果毋庸置疑，但对其物质基础和作用机制的判断大多来自于临床中的实践经验总结，缺乏量化的科学依据去揭示内在起效的“黑箱”部分。因此，在中药现代化的发展进程中，中药复方药效物质基础和作用机制的研究既是重点也是难点。之前几十载的科学实验中，研究人员通过不同的分离手段获得大量有活性的中药单体成分，但这样的研究方法忽略了中医药的基础理论，存在一定的局限性。现今，超分子组装给予了一个新视角，基于此研究分子间的相互作用及药效上的改变，为中药复方物质基础的研究提供新思路，也为新制剂的开发及纳米制剂的临床转化提供新视角。

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