木质纤维素包含纤维素（35%~50%）、半纤维素（20%~30%）和木质素（20%~30%），占植物类生物质的90%以上，是地球上最主要的可再生碳资源。

01

材料与方法

1.1　试验材料

1.2　试验方法

1.2.1　磷酸润胀纤维素的制备

1.2.2　酶水解

1.2.3CBHＩ和βX酶活力的测定

1.2.4CBHＩ和βX的抑制动力学参数的测定

1.2.5　糖含量的测定

02

结果与分析

前人研究表明，木质素降解产物在低浓度时（≤1mg/mL）对纤维素酶的抑制作用很弱，但是随着木质素降解产物浓度的增加，其抑制效果明显增强。当产物质量浓度为5.0mg/mL时，抑制效果明显增强。当香草醛添加量增加到mmol/L时，纤维素酶完全被抑制，几乎检测不到水解产物。由于香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛的结构比较相似，其对纤维素酶的抑制效果较为接近。Li等对比了几种和香草醛结构相似的酚类物质对纤维素酶的抑制作用，发现香草醛和4-羟基苯甲醛对纤维素酶的抑制效果基本相同。Qin等的研究发现香草醛和丁香醛对纤维素酶的抑制效果差异不明显，但是4-羟基苯甲醛的抑制效果相对较弱。这些差异可能是由于纤维素酶的种类和组成不同导致的。

2.2　木质素降解产物对β-葡萄糖苷酶水解的影响

纤维素商品酶Cellclast1.5L中因β?葡萄糖苷酶酶活较低，多与商品β-葡萄糖苷酶Novozyme配合使用，以将内切或外切葡聚糖酶（EG或CBH）水解产生的纤维二糖水解成葡萄糖，缓解纤维二糖对外切葡聚糖酶的抑制。笔者选用商品酶Novozyme作为β-葡萄糖苷酶，研究3种木质素降解产物对其水解纤维二糖的影响，结果如图2所示。添加不同浓度的3种木质素降解产物，水解48h后的葡萄糖得率几乎都为％，即香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛对β?葡萄糖苷酶的水解没有影响，即使质量浓度达到10.0mg/mL也没有抑制。Mhiongo等也发现香草醛和4-羟基苯甲醛对β?葡萄糖苷酶的酶活没有抑制。但也有研究表明，木质素降解产物能显著降低商品纤维素酶Spe-zymeCP中的β-葡萄糖苷酶酶活。这可能是由于不同菌种产生的β?葡萄糖苷酶对酚类物质的耐受性不同，由黑曲霉Aspergillusniger产生的β-葡萄糖苷酶对香草醛和丁香醛有较高的耐受性。

2.3　木质素降解产物对外切葡聚糖酶CBHＩ的影响 　　

外切葡聚糖酶CBHＩ是商品纤维素酶中的重要成分之一，也是水解纤维素的关键酶，其作用是水解纤维素还原末端产生纤维二糖。笔者通过香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛3种木质素降解产物对CBHＩ或CBHＩ和β-葡萄糖苷酶共同水解PASC的影响，来考察其对CBHＩ的影响。CBHＩ水解PASC的主要产物是纤维二糖，当加入质量浓度为2.0mg/mL的香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛，水解24h后产生的纤维二糖质量浓度由0.90mg/mL分别降到0.84，0.86和0.81mg/mL（图3a），即水解产生的纤维二糖量分别减少了5.62％，3.37％和8.99％。当加入β-葡萄糖苷酶后，纤维二糖被其水解成葡萄糖，水解24h后上清液中葡萄糖质量浓度由2.27mg/mL分别减少到2.13，2.18和2.08mg/mL，即葡萄糖含量分别减少了6.17％、3.96％和8.37％。虽然这3种木质素降解产物抑制CBHＩ水解的能力较弱，但是加入质量浓度为2mg/mL的3种木质素降解产物后，CBHＩ酶活分别只剩下79.64％，86.76％和71.89％（图3b），这表明香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛对CBHＩ的酶活有较强的抑制，且丁香醛的抑制能力最强，4-羟基苯甲醛的抑制能力最弱。Mhlongo等研究也发现丁香醛对CBHＩ酶活的抑制作用比香草醛和4-羟基苯甲醛强，其他的木质素降解产物例如单宁酸、肉桂酸也对CBHＩ有很强的抑制。Zhai报道预处理上清中的酚类物质能强烈抑制纤维素酶活性，尤其是CBHＩ酶活。

2.4　木质素降解产物对木聚糖酶水解的影响

香草醛、４-羟基苯甲醛和丁香醛对木聚糖酶水解的影响如图4所示，当酚类物质的质量浓度为0.5mg/mL时对木聚糖酶水解抑制作用很弱，但加入5.0mg/mL的香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛后，木糖得率明显降低。木聚糖酶水解榉木木聚糖12h后，木糖得率从24.43％分别降到15.70％，15.04％和17.59％（图4a），这说明3种木质素降解产物对木聚糖酶水解的抑制作用很强。当分别加入10.0mg/mL的香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛后，木聚糖酶水解28h后的木糖得率由57.28％分别降至20.16％，12.26％和30.43％（图４ｂ），即３种酚类对木聚糖酶的抑制强弱顺序为：4-羟基苯甲醛＞香草醛＞丁香醛。Boukari等发现肉桂酸等木质素降解产物在浓度小于10mmol/L时对木聚糖的水解没有抑制，当浓度达到mmol/L时能强烈地抑制木聚糖酶的酶活。也有研究发现香草酸和原儿茶酸在低浓度时（质量浓度不超过0.05％）能提高木聚糖的水解率。Moreira等从Aspergillusterreus菌中分离得到两种不同的木聚糖酶XylT1和XylT2，研究发现XylT1的酶活能被木质素降解产物如香草醛、4-羟基苯甲酸、单宁酸等不同程度抑制，但是XylT2却对这些酚类有非常强的耐受性，几乎不被抑制，这说明不同的木聚糖酶对木质素降解产物的耐受性不同。

2.5　木质素降解产物对βX水解的影响

在木质纤维原料的酶水解过程中，βX能协同木聚糖酶将木聚糖及低聚木糖转化为木糖，减少中间产物低聚木糖对纤维素酶的强烈抑制。香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛对βX水解低聚木糖的影响如图5所示。随着这3种木质素降解产物质量浓度的不断增高，对βX的抑制效果不断增强，水解产生的木糖量降低。当添加质量浓度为10.0mg/mL的香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛时，水解产生的木糖质量浓度由3.16mg/mL分别降到0.57，0.43和1.16mg/mL。上述结果说明，这3种木质素降解产物对βX有很强的抑制，其抑制强弱顺序为：4-羟基苯甲醛＞香草醛＞丁香醛。该结果也与热水预处理甘蔗渣上清液中的酚类物质对木聚糖酶酶活和βX酶活均有很强抑制的结果相似。

2.64-羟基苯甲醛对CBHＩ和βX的抑制动力学

前期结果表明，香草醛、４?羟基苯甲醛和丁香醛对CBHＩ和βX有较强的抑制作用，但是其抑制机理尚不明确。由于香草醛和丁香醛对pNP检测有较强干扰，此外，目前检测内切葡聚糖酶活EG和内切木聚糖酶活XYL时，均需要检测还原糖的含量，而动力学实验中添加的４?羟基苯甲醛会影响还原糖的准确测定，因此笔者仅考察了4-羟基苯甲醛对CBHＩ和βX反应动力学的影响。将不同浓度的（0～1.00mg/mL）4-羟基苯甲醛添加到不同浓度的pNPC或pNPX溶液中，分别研究CBHＩ或βX对它们的水解速率的变化来检测4-羟基苯甲醛对酶水解动力学的影响，并根据米氏方程的双倒数曲线对水解速率倒数1/V和酶活底物浓度倒数1/S作图（图6）。结果表明，添加不同浓度的4-羟基苯甲醛后，CBHＩ的双倒数曲线均交于Ｙ轴，这表明4羟基苯甲醛对CBHＩ的抑制作用属于竞争性抑制（图6a）。Jing等研究了4-羟基苯甲醛等对商品纤维素酶（SpezymeCP）的抑制动力学，发现4-羟基苯甲醛是该商品纤维素酶的竞争性抑制剂，这与本课题研究结果类似，由此说明4-羟基苯甲醛对商品纤维素酶的抑制主要是对CBHＩ的抑制。添加4-羟基苯甲醛后，βX的双倒数曲线交于X轴，这表明4-羟基苯甲醛对βX的抑制作用属于非竞争性抑制（图6b）。

结论

１）香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛对纤维素酶和木聚糖酶均有很强的抑制作用，其抑制效果与浓度呈正相关。低浓度时（0.5mg/mL）抑制作用很弱，当底物质量浓度达到10.0mg/mL时抑制作用显著增强，并且这3种木质素降解产物对纤维素酶的抑制效果差异不大，但对木聚糖酶的抑制效果差异较大，其对木聚糖酶水解的抑制强弱顺序为：4-羟基苯甲醛＞香草醛＞丁香醛。

２）香草醛、4-羟基苯甲醛和丁香醛对β-葡萄糖苷酶没有抑制作用，但是能强烈抑制CBHＩ和βＸ，且３种木质素降解产物的对mg/mL抑制强弱顺序为：丁香醛＞香草醛＞4-羟基苯甲醛，对βＸ的抑制强弱顺序与木聚糖酶一致。

３）通过抑制动力学方程分析，结果表明4-羟基苯甲醛对CBHＩ的抑制属于竞争性抑制，对βＸ的抑制属于非竞争性抑制。

该文发表于《林业工程学报》年第4期。

引文格式：

王锐,辛东林,张军华.木质素降解产物对纤维素酶和木聚糖酶水解的抑制[J].林业工程学报,,4(4):78-84.WANGR,XINDL,ZHANGJH.Inhibitoryeffectsofvanillin,4-hydroxybenzaldehydeandsyringaldehydeoncellulasesandxylanases[J].JournalofForestryEngineering,,4(4):78-84.