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遇见-摘要C4不饱和化合物1,3-丁二烯是合成橡胶和工程塑料生产中的重要单体，而当葡萄糖通过生物过程作为可再生碳源时，微生物不能直接产生1,3-丁二烯。这篇文章将cis,cis-muconicacid（ccMA）产生途径与阿魏酸脱羧酶突变结合，构建了大肠杆菌中葡萄糖生产1,3-丁二烯的人工代谢途径。通过计算机模拟设计酶的底物结合位点，提高了ccMA脱羧反应的效率，由此产生1,3-丁二烯。研究发现改变溶解氧（DO）水平和控制pH是影响1,3-丁二烯生产的重要因素。本文表明通过合理的酶设计策略可以从葡萄糖中获取非天然的化合物作为一种可再生碳源。遇见-内容1.3-丁二烯是最简单的C4共轭二烯，是最有价值的工业原料之一。用于生产合成橡胶和工程塑料。几乎所有的1,3-丁二烯通常由C4馏分合成，C4馏分是乙烯生产过程中的naphtha(石脑油)裂解产生的。然而，目前正在被广泛使用的是从页岩气中提取廉价的乙烯来生产1,3-丁二烯，由于石脑油中乙烯的减产以及预计1,3-丁二烯的供需缺口的增加，近年来为了解决这个问题，基于生物研究1.3-丁二烯的生产日益增多，但直接从葡萄糖合成1,3-丁二烯可再生的碳源尚未实现。粘酸是一种不饱和的六碳羧酸，具有一种共轭二烯，以三种不同的异构体存在：顺式、顺式粘液酸（ccMA）；顺式、反式粘液酸（ctMA）和反式、反式粘液酸（ttMA）。ccMA是一种天然代谢物参与芳香化合物的分解途径，具有不同中间化合物的路径。这里，它假设1,3-丁二烯可以由ccMA的两个十二碳羧化反应生成（图1）。阿魏酸脱羧酶（FDC），UbiD的一个成员家族酶，介导苯丙烯酸的脱羧酸衍生物并将其转化为末端烯烃。最近发现了辅酶体异戊二烯化黄素单核苷酸（prFMN），发现FDC与prFMN结合可以催化脱羧反应，不仅能识别芳香族化合物，而且能识别芳香族化合物也α,β-产生末端的不饱和羧酸烯烃。因此，选择FDC作为模板酶从橡胶中生产丁二烯的酶α,β-不饱和二羧酸ccMA。首先设计从ccMA生物合成1,3-丁二烯的AnFDC突变体。本文选择了来自黑曲霉和酿酒酵母的FDCs（分别是AnFDC和ScFDC），以AnFDC作为模板脱羧酶用于1,3-丁二烯的生产。AnFDC的脱羧需要prFMN、Q和R，AnFDC的底物特异性由底物结合位点周围的其它残基决定，α-甲基肉桂酸结合的AnFDC模型显示R与α-甲基肉桂酸的羧基相互作用（图2a）。利用MOE软件建立了AnFDC与ccMA结合的模型，研究人员在硅片上产生了单取代突变体，并将其按亲和性的顺序排列，然后产生了前25个AnFDC突变体，对获得的25个AnFDC突变体的活性进行评估（图2b）。为了进一步提高ccMA的底物特异性，研究人员创建了一个多突变体文库并获得了最优组合AnFDCYH:TQ，其结果显示1,3-丁烷二烯产量增加了±35.6倍。这些结果表明FDC突变体和ccMA之间的相互作用能够有效地捕获ccMA，提高酶产生1,3-丁二烯的能力。利用AnFDC突变体设计开发和鉴定ScFDC突变体。研究者基于AnFDC突变体的设计构建了ScFDC突变体。AnFDC蛋白与ScFDC蛋白序列同源性为48.4%，其底物结合位点有三个差异；在AnFDC中的氨基酸残基A:Y:T对应于ScFDC中的氨基酸残基V:F:I。除WTAnFDC外，WTScFDC还介导ccMA脱羧化（图3a）。采用最佳设计的ScFDCFH:IQ，设计最佳的AnFDCYH:TQ显示活性比WT-ScFDC高.9±17.2倍。ScFDCFH:IQ和ccMA的模拟模型表明，两个取代残基与羰基膦相互作用（图3b）。同时作者还测定了pH对ScFDCFH:IQ酶的影响，结果当pH为6.0时酶活最好（图3c）。由于过度暴露在氧气中会导致酶活性丧失，因此作者也测定了好氧/缺氧条件下培养ScFDCFH:IQ，添加ccMA并测定其酶活性，结果（图3d）显示由于持续的氧暴露FDC的活性降低。构建产生ccMA的大肠杆菌为了构建一条由葡萄糖合成1,3-丁二烯的人工途径，研究者开发了一种用于ccMA生产的大肠杆菌菌株。在这项研究中，作者选择了涉及原儿茶酸（PCA）的途径，据报道最短的途径是ccMA产生途径，并进行了基因组工程以高效产生ccMA。在通过PCA的ccMA途径中，ccMA由3-脱氢莽草酸（3DHS）经3DHS脱水酶（aroZ）、原儿茶酸脱羧酶（aroY）和邻苯二酚双加氧酶（catA）三步反应生成。对于ccMA的产生，这些基因被整合到CFB01、CFB11和CFB21中，这些基因构成了产生芳香族衍生物的大肠杆菌菌株（图4），成功地获得了一个产生ccMA的大肠杆菌株（CFB21）。构建能生产1,3-丁二烯的人工代谢途径将产生ccMA的大肠杆菌菌株与ScFDC突变株结合，构建了葡萄糖产生1,3-丁二烯的人工合成途径。将菌株经过组装后进行培养，使其生长并消耗葡萄糖，同时检测1,3-丁二烯的产生（图5）。为了检测氧气条件对丁二烯生产的影响，好氧条件适合于FDC的活化和培养早期ccMA的生产，而缺氧条件则需要维持FDC的活性。葡萄糖消耗和细胞生长随着培养基与空气相比率的增加而增加，但在培养24小时后停止（图6a）。ccMA、PA及丁二烯的产率也随着培养基与空气相比率的增加而增加(图6b,6c）。这些结果表明平衡好氧和缺氧条件是1,3-丁二烯生产的一个重要因素。在优化好相关条件后，研究人员进行了罐式发酵，实验发现在60小时停止生产1,3-丁二烯，为了增加丁二烯产量，需要从好氧条件转换为微好氧条件。接下来，在pH为6.0的DO转换条件下进行CFB发酵（图7）。为了进一步提高丁二烯产量，请进行静态补料发酵（图8）总计在96小时由葡萄糖产生2.13±0.17gL–1的1,3-丁二烯，通过改变发酵液中溶解氧的水平进行静态补料分批发酵成功地提高了1,3-丁二烯的产量。

这篇文章合理设计蛋白质诱变以拓宽目标酶的功能，构建了由葡萄糖直接生产1,3-丁二烯的人工代谢途径，利用计算机辅助设计有助于提高酶的活性靶蛋白的理想功能。在此基础上通过对发酵条件的优化，尤其是需氧情况和pH，成功构建并提高了1,3-丁二烯的产量，通过酶的策略来产生非天然/非生物化合物将在可持续社会中形成循环生物经济。

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