1概要

苯甲酸是一种工业上重要的芳香化合物，有着广泛的应用。例如，苯甲酸可用作合成许多重要商品化学品的前体，例如：对苯二甲酸、苯酚和ε-己内酰胺等。而且由于具有抗微生物特性，苯甲酸及其各种盐类(如钾、钠和钙)也被广泛用作食品、化妆品和制药工业中的防腐剂。目前，苯甲酸是通过化学方法从甲苯氧化中生产的，该方法在高温高压下使用重金属催化剂如环烷酸钴或锰。此外，甲苯来自不可再生的石油资源，这使得整个过程不可持续。除了与温和的生物过程相关的环境益处之外，生物获得的苯甲酸被认为是“天然的”，这是其在食品、化妆品和药物中应用的主要优势。

在这里，他们报道了利用含有植物样β-氧化途径和新设计的合成途径的代谢工程大肠杆菌菌株从葡萄糖中从头生产苯甲酸。首先，通过电子通量响应分析系统地评估了来源于植物的三种不同的天然苯甲酸生物合成途径和一种合成设计的途径从葡萄糖生产苯甲酸。通过在大肠杆菌中表达编码必需酶的基因和在最佳质粒配置下筛选异源酶，分别建立了所选的植物样β-氧化途径和合成途径。通过对含有各种代谢途径的工程大肠杆菌菌株应用多种代谢工程策略，进一步优化了苯甲酸的生产，包括增强前体的可用性、消除竞争反应、转运体工程和减少副产物的形成。最后，对最终的β-氧化途径工程菌和合成途径工程菌进行补料分批发酵，分别从葡萄糖中获得2.37±0.02g/L和.0±5.8mg/L的苯甲酸；前者是微生物发酵报道的最高浓度。此处开发的代谢工程策略将有助于生产高工业价值的相关芳烃。

2研究过程与结果

2.1四种苯甲酸形成的途径

这里介绍了四种苯甲酸形成的途径，其中三种为已确定的源自一种常见的前体L-PHE（L-苯丙氨酸）植物代谢途径。三种植物苯甲酸途径可被指定为辅酶A依赖的β-氧化途径(Ⅰ)、辅酶A依赖的非β-氧化途径(Ⅱ)和辅酶A非依赖的非β-氧化途径(Ⅲ)。除了上述天然的苯甲酸途径外，还设计了一种新的人工途径，用于从葡萄糖开始从头合成苯甲酸，其基于不同来源的合成装配的S-MA合成和降解途径。具体来说，S-MA首先是由葡萄糖直接通过前体苯基丙酮酸(PPA)合成的，它是大肠杆菌中L-PHE（L-苯丙氨酸）生物合成的中间体。接下来，S-MA通过S-MA脱氢酶转化为苯乙醛酸(PGA)，然后通过PGA脱羧酶将PGA脱羧为BALD。最后，BALD被BALD脱氢酶氧化成苯甲酸。整个途径既不依赖辅酶A形成，也不以β-氧化方式运行，因此被称为合成辅酶A非依赖性非β-氧化途径。

2.2葡萄糖通过辅酶A依赖的β-氧化途径Ⅰ-变体产生苯甲酸

第一步是通过肉桂酸-辅酶A连接酶将CA激活成肉桂酰辅酶A。在本研究中，选择了天蓝色链霉菌A3(2)的肉桂酸-辅酶A连接酶(由ScCCL编码)，因为它来自细菌。此外，它的一个变体(由ScCCLAG编码)显示出极大的增强活性被用于本研究。为了进一步将肉桂酰辅酶A转化为苯甲酸，从谷氨酸棒状杆菌ATCC的phd基因簇中选择了编码相应酶的三个基因(phdE、phdB和PhdC）。

途径Ⅳ的初始物为PPA，虽然PPA是L-PHE的直接前体，但所用的LLD2菌株最初是为过量生产L-PHE而不是PPA而设计的(图2B)。为了加强PPA的可用性，由于LLD2菌株是已经敲除了tyrA基因的，所以只需敲除LLD2菌株(图2B)中的tyrB和aspC基因(分别编码酪氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶)，产生LLD6菌株，减少了L-PHE合成对PPA的消耗。